간 RBFOX2는 생쥐의 Scarb1 대체 접합을 통해 콜레스테롤 항상성을 조절합니다

Nature Metabolism 4권, 1812~1829페이지(2022)이 기사 인용

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RNA 대체 접합(AS)은 진핵생물 게놈의 조절 가능성을 확장합니다. 간 특정 AS 프로필을 조절하는 메커니즘과 간 기능에 대한 기여는 잘 알려져 있지 않습니다. 여기에서 우리는 간의 지방생성 환경에서 콜레스테롤 항상성을 유지하는 데 있어 스플라이싱 인자 RNA 결합 Fox 단백질 2(RBFOX2)의 핵심 역할을 식별합니다. 향상된 개별 뉴클레오티드 해상도 자외선 가교 및 면역 침전을 사용하여 우리는 청소부 수용체 클래스 B 유형 I(Scarb1)을 포함하여 마우스 간에서 RBFOX2의 생리학적으로 관련된 표적을 식별합니다. 식이 유발 비만의 경우 간에서 RBFOX2 기능이 감소하여 Scarb1 이소형 스위치가 발생하고 간세포 지질 항상성이 변경됩니다. 우리의 연구 결과는 특정 AS 프로그램이 간 생리를 적극적으로 유지하고 조절 장애가 있을 때 비만 유발 식단의 지방 독성 효과의 기초가 된다는 것을 보여줍니다. 이 네트워크를 목표로 하는 스플라이스 전환 올리고뉴클레오티드는 간에서 비만 유발 염증을 완화하고 혈액 내 항동맥경화성 지질단백질 프로필을 촉진하여 대사 관련 질병 치료를 위한 이소형 특이적 RNA 치료제의 잠재력을 강조합니다.

포유류에서 대부분의 다중 엑손 유전자는 AS를 거쳐 여러 이소형1,2을 생성하고 전사 복잡성에 기여합니다3. AS는 조직 특이적 단백질 상호작용 네트워크4,5,6 및 조직 정체성6의 확립 및 유지에 중요한 것으로 생각됩니다. 특정 AS 프로그램이 생리적 적응을 조절하는지 여부는 잘 알려져 있지 않으며, 특정 이소형의 기능적 특성이 좋지 않고 생체 내에서 특정 업스트림 조절 접합 인자를 식별하는 데 관련된 기술적 문제로 인해 대사 질환에서의 역할이 불분명합니다. 따라서 스플라이싱 인자와 그들이 조절하는 이소형 수준 모두에서 대사 재프로그래밍과 관련된 스플라이싱 네트워크에 대한 정보가 제한되어 있습니다. 건강과 질병의 대사 조절에 대한 지식을 늘릴 뿐만 아니라, 대사 조절과 관련된 접합 인자와 이소형의 특성화는 특정 이소형을 조절하는 RNA 기반 치료법의 개발로 이어질 수 있습니다. 간에서 특정 유전자를 비활성화하는 RNA 기반 치료법은 대사성 병리학에 대한 유망한 치료 전략으로 떠오르고 있습니다7,8. 그러나 스플라이스 스위칭 RNA 치료제는 아직 연구되지 않았습니다.

전 세계적으로 비만이 증가함에 따라 대사 관련 지방간 질환(MAFLD)이 가장 널리 퍼진 비전염성 간 병리학이 되었습니다9. MAFLD는 증상 전 간 지방증(지방간)부터 염증, 간세포 손상 및 섬유증을 특징으로 하는 비알코올성 지방간염까지 다양하며 간부전, 간경화 및 간세포암종(HCC)으로 진행될 수 있습니다10.

지방증이 비알코올성 지방간염으로 진행되는 것을 촉진하는 정확한 기전은 완전히 이해되지 않았지만, 증거에 따르면 만성 영양 과잉 및 고열량 서구식 식단이 인지질, 포화 지방산과 같은 생리 활성 및/또는 독성 지질종의 조절 장애에 기여한다는 증거가 있습니다. , 스핑고미엘린, 세라마이드 및 콜레스테롤11,12,13. 또한 MAFLD가 제2형 당뇨병 및 심혈관 질환의 발병에 기여하며 관상동맥 질환이 이들 환자의 주요 사망 원인이라는 증거가 있습니다14,15. MAFLD가 심혈관 위험 증가 및 진행성 간 손상과 어떻게 연관되어 있는지 이해하면 새로운 치료 목표를 식별하는 데 도움이 됩니다.

여기에서 우리는 pre-mRNA AS 기계의 구성 요소가 간에서의 대사 입력에 의해 선택적으로 조절된다는 것을 발견했습니다. 우리는 RNA 결합 fox-1 상동체 2(RBFOX2)가 간에서 주요 접합 인자로 확인되어 스캐빈저 수용체 클래스 B 유형 I(Scarb1), 포스포리파제 A2 그룹 VI를 포함하여 지질 항상성과 관련된 유전자 클러스터에서 AS를 조절합니다. Pla2g6), COPII 소포 수송 시스템 Sec31a 및 옥시스테롤 결합 단백질 유사 9(Osbpl9)의 구성 요소인 clathrin 소포 어댑터 Numb. 우리는 RBFOX2가 비만 유발 식단에 반응하여 AS를 조절하고 RBFOX2에 의해 조절되는 AS 네트워크가 치료적으로 표적화될 수 있음을 밝힙니다. Scarb1 스플라이싱을 조절하는 스플라이스 전환 올리고뉴클레오티드(SSO)는 RBFOX2가 결핍된 마우스 간세포에서 지방 독성 종의 축적을 되돌리고 생체 내 식이 유발 비만과 관련된 간 염증을 완화하며 혈액 내 항동맥경화성 지단백질 프로필을 촉진하여 다음과 같은 가능성을 보여줍니다. 대사 병리학을 위한 이소형 특이적 RNA 치료제.

TTACTGACCGTACACCAAATTTGCCTGC and CreR1>CCTGGCAGCGATCGCTATTTTCCATGAGTG, Rbfox2F1> AACAAGAAAGGCCTCACTTCAG and Rbfox2R1>GGTGTTCTCTGACTTATACATGCAC. All in vivo work was approved by the animal welfare and ethical review board at Imperial College London and in accordance with the United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act (1986)./p>

100 and an isolation specificity >0.7 were used for quantification. Each TMT was normalized to the total signal in each column. To allow the comparison of both TMT, those proteins quantified in both TMT, data were normalized using the bridge channels present in each TMT. Quantifications included in Supplementary Table 1 are represented as relative abundances. Newly generated proteomic datasets are publicly available as described below./p> 8, was performed and libraries were prepared using the NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina and multiplexed using NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (NEB, E7760S and E7335S). Sequencing was carried out with 100 basepair paired end reads with HiSeq 2500 (Illumina). Newly generated RNA-seq datasets are publicly available as described below. Previously published datasets of mice fed a HFr diet were obtained from GSE123896 (ref. 16). Data were processed using RTA v.1.18.54, with default filter and quality settings. The reads were demultiplexed with CASAVA v.2.17. Reads were aligned to Ensembl mouse genome (GRCm38) using Tophat2 (v.2.0.11)61 with the argument ‘–library-type fr-firststrand’. Reference sequence assembly and transcript annotation were obtained from Illumina iGenomes (https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.html). Gene-based read counts were obtained using featureCounts function from Rsubread Bioconductor package62. Normalization and differential expression analysis were performed using DEseq2 (ref. 63) or edgeR-voom-limma64,65,66,67 bioconductor packages. AS was primarily analysed with rMATs68. Differentially spliced sites were kept for data visualization if they passed the following threshold: P < 0.05; FDR < 0.1 and absolute(IncLevelDifference) >0.1 or <-0.1. Gene ontology analysis was carried out by using GOseq Bioconductor package69. A list of differentially expressed genes with adjusted P value of less than or equal to 0.05 were selected as input for the ingenuity pathway analysis (http://www.ingenuity.com/index.html). No cut-off was applied for fold change of differential expression. Enrichment of binding motifs for different splicing factors were tested using the binomTest function from the edgeR bioconductor package70./p>$OUTPUT.adapterTrim.fastq 2 > $OUTPUT.adapterTrim.metrics’./p>

0.2/p>