높은 이중 에멀젼 - 불산 광산 연구소 그룹 유한 회사

ISME 커뮤니케이션 3권, 기사 번호: 47(2023) 이 기사 인용

2002년 액세스

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측정항목 세부정보

현장 미생물 생리학에 대한 우리의 이해는 주로 빠르게 성장하고 쉽게 분리할 수 있는 미생물의 생리학적 특성을 기반으로 합니다. 낮은 성장 속도 또는 낮은 영양분 환경에 적합한 생리학을 가진 새로운 분리물을 얻기 위한 미생물 농축은 표준 실험실 분리 프로토콜을 사용할 때 가장 빠르게 자라는 종에 대한 본질적인 편견으로 인해 어려움을 겪습니다. 이러한 편견을 최소화하고 잘 연구되지 않은 분류군을 강화하기 위한 새로운 재배 도구가 필요합니다. 본 연구에서 우리는 단일 세포 캡슐화 및 이중 에멀젼(GrowMiDE) 내 성장을 기반으로 처리량이 높은 박테리아 농축 플랫폼을 개발했습니다. 우리는 GrowMiDE가 다양한 미생물을 배양하고 전통적인 배치 농축에서는 결코 관찰되지 않는 잘 알려지지 않은 분류군을 농축할 수 있음을 보여주었습니다. 예를 들어, 이중 에멀젼 액적 내의 영양분 사유화로 인해 빠르게 성장하는 미생물에 의한 농축의 우세를 방지하면 리치 미디어 농축 배양의 대변 샘플에서 느리게 성장하는 음성균 및 메탄박테리아를 배양할 수 있습니다. 성장률과 성장 수율 전문 균주 간의 경쟁 실험에서 GrowMiDE 농축은 공유 영양 풀에 대한 경쟁을 방지하고 성장 속도는 느리지만 보다 효율적인 균주를 강화했습니다. 마지막으로, 우리는 GrowMiDE 농축물로부터 분리물을 얻기 위해 상업용 형광 활성화 세포 분류(FACS)와 GrowMiDE의 호환성을 입증했습니다. GrowMiDE + DE-FACS는 다양한 미생물 농축 또는 스크린에 쉽게 적용할 수 있는 유망한 새로운 고처리량 농축 플랫폼입니다.

미생물 생리학에 대한 우리의 이해는 주로 순수 배양에서 분리된 미생물을 사용한 연구를 기반으로 합니다. 지난 140년 동안 새로운 미생물을 분리하기 위한 기술에는 실험실에서 자연 조건을 모방하는 유리한 환경과 영양분 흐름을 재현한 다음 자란 새로운 종을 복구하려는 시도가 포함되었습니다. 결과적으로, 현재의 방법은 본질적으로 공유 영양소에 대해 다른 종, 심지어 최대 성장률(μMax)에 약간의 차이가 있는 종을 능가할 수 있는 빠르게 성장하는 미생물에 편향되어 있습니다(그림 S1-S3) [1, 2]. 누락된 느리게 자라는 종은 자연 환경에 적응하기 위한 알려지지 않은 생리학적 전략을 가지고 있을 수 있으며 이는 공동체 회복력에 중요한 역할을 할 가능성이 높습니다[3]. 예를 들어, 낮은 영양 플럭스나 생물막[1, 2, 4] 및 해양 지하 환경(지구 바이오매스의 ~30%)을 포함한 공간적으로 구조화된 환경에서 생존 전략으로 성장률보다 성장 효율(성장 수율)이 제안되었습니다. [5,6,7,8]. 추가적인 중요한 과제는 다양한 미생물 생활 방식(예: 올리고영양체 또는 부영양체)의 성장을 지원하는 적절한 화학적 환경을 조성하는 것입니다. 따라서 빠른 미생물 성장 속도에 대한 편견을 최소화하는 새로운 재배 도구를 개발하는 것이 중요합니다.

한정된 자원에 대한 경쟁을 제한하는 전통적인 방법(예: 영양분 사유화)은 일반적으로 공간적 분리에 의존하며 희석에서 멸종까지 또는 군집 형성 단위에 대한 도금을 포함합니다[9, 10]. 그러나 이러한 기술은 세포 풍부도에 의존하고 처리량이 낮으며 공기-액체 경계면에서 잘 자라지 않는 미생물, 특히 혐기성 미생물을 복구하는 데 도움이 되지 않습니다[11, 12]. 액적 미세유체 접근법은 각각 성장에 필요한 시약의 정확한 분포를 갖춘 격리된 생물반응기에서 새로운 미생물을 배양하는 강력한 고처리량 기술로 등장했으며[10, 13,14,15,16], 항생제 내성에 대한 스크린을 촉진합니다[13, 17, 18] 및 세포 활동 측정 [19,20,21]. 대부분의 미생물학적 액적 접근법은 단일 에멀젼 액적을 사용하며, 여기서 세포와 배지를 포함하는 수성 액적은 오일상 내에 부유됩니다. 많은 연구에서 미생물 다양성 조사[21,22,23,24], 고품질 게놈 획득[25] 및 기능적 스크린[10, 13, 16, 18]을 위한 단일 에멀젼 액적 미세유체의 유용성을 보여주었습니다. 단일 에멀젼 농축 기술은 또한 성장 수율이 높거나 성장 속도가 느린 균주에 대한 선택을 보여 주었으며, 이는 농축 결과에 대한 영양 사유화의 영향에 대한 개념 증명 역할을 합니다[26]. 그러나 단일 에멀젼 액적은 다운스트림을 분석하기 위해 맞춤형 장비가 필요하며 느린 분류 속도와 제한된 형광 채널로 개념 증명 시연에서만 분류되었으므로[27, 28] 새로운 시스템에 적용하기가 어렵습니다.

99% purity, 70% single droplet recovery) in traditional FACS instruments [33, 34]. Current applications for DE technology include cell encapsulation [21, 29], drug delivery [31], and protein function screens [21]. However, DEs have not yet been used as an enrichment platform for microorganisms./p>

50% DE recovery in 96 well plates for 30 µm DEs. Event rates for FACS analysis were kept below 1000 events/s and sorting rates were maintained under 50 events/s. Gain settings for DE-FACS were described previously [33], with the exception of the FITC gain, which was set to 32% or 40% for E. coli GFP or SYTO-stained cells, respectively. Sorted DEs were deposited into either FACS tubes or 96 well plates pre-loaded with 100 µL of osmolarically-balanced outer solution based on inner core media components. Sorted DE populations were imaged on a Leica DM4000B-M fluorescence microscope and a Leica DM E brightfield microscope./p>