게놈에서 - 불산 광산 연구소 그룹 유한 회사

커뮤니케이션 생물학 6권, 기사 번호: 277(2023) 이 기사 인용

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SARS-CoV-2에 대한 예방적 접근법, 특히 스파이크의 항원 표류에 저항하는 전략을 확장하는 것이 가장 중요합니다. 여기에서 우리는 초강력 siRNA를 식별하기 위해 대규모 병렬 분석을 사용하여 SARS-CoV-2 게놈에 대해 16,000개 이상의 RNAi 트리거에 대한 스크린을 수행했습니다. 우리는 시험관 내 검증을 위해 10개의 후보를 선택했고, 라이브 바이러스 실험에서 초강력 활성(IC50 < 20 pM)과 강력한 감염 차단을 나타내는 5개의 siRNA를 발견했습니다. 우리는 siRNA 후보의 조합 페어링을 통해 이 활동을 더욱 강화하고 여러 유형의 우려되는 변종(VOC)에 대해 활성이 있는 칵테일을 식별했습니다. 그런 다음 포화 돌연변이 유발을 사용하여 siRNA 표적 부위에서 2,000개 이상의 가능한 돌연변이를 조사하고 미래 변이체에 대해 주요 칵테일이 광범위하게 보호된다는 것을 확인했습니다. 마지막으로, 우리는 이 siRNA 칵테일의 비강내 투여가 표준 시리아 햄스터 모델에서 질병의 임상 징후와 바이러스 측정을 효과적으로 약화시킨다는 것을 입증했습니다. 우리의 결과는 백신 및 단일클론 항체와 직교하는 항바이러스 예방의 추가 계층을 개발할 수 있는 길을 열었습니다.

코로나19는 현대 세계 최악의 전염병 중 하나였습니다. 백신이 큰 성공을 거두었지만 일부 단점을 해결하기 위해 예방 조치의 무기고를 확장해야 할 긴급한 필요성이 있습니다1. 첫째, 사실상 모든 허가된 백신은 스파이크 단백질을 표적으로 삼고2,3 탈출 돌연변이와 신흥 악성 변종4,5,6,7,8에 대한 노출을 고려할 때 단일 실패 지점에 수렴됩니다. 더욱이 모든 단클론 항체(mAb) 치료법은 이 동일한 단백질을 표적으로 삼기 때문에 이러한 항원 변화는 백신의 보호를 방해할 뿐만 아니라 광범위한 다른 치료법의 효능을 감소시킬 수도 있습니다. 둘째, 여러 연구에 따르면 중증 질병을 포함한 백신의 보호 효과는 일반적으로 2차9, 3차10,11 또는 4차 접종 후 단 몇 달 이내에 약화됩니다12. 셋째, 생쥐와 인간이 아닌 영장류(NHP)에서 파생된 최근의 증거에 따르면 업데이트된 버전의 백신은 효능이 감소하고 바이러스에 처음 노출되면 후속 노출의 결과가 결정될 때 원래의 항원성 죄의 대상이 될 수 있습니다13,14 항원 관련 균주에 적용됩니다. 이러한 데이터는 우려되는 새로운 변종(VoC)에 대한 백신 업데이트의 유용성이 제한적임을 시사합니다. 넷째, 팍슬로비드(Paxlovid)와 같은 항바이러스제는 코로나19 노출로부터 성인을 보호하는 데 부족했습니다. 마지막으로, 여러 연구에서는 반복 투여 후에도 면역력이 저하된 개인에게서 높은 보호를 달성하는 것이 어렵다는 점을 지속적으로 보여 주며15, 이는 백신이 가장 필요한 개인이 백신으로 혜택을 받을 가능성이 가장 적음을 암시합니다. 마지막으로 면역이 저하된 개인의 감염은 장기간 지속될 수 있으며16,17 이는 과다 진화 및 VoC 출현 위험을 증가시켜 공중 보건에 주요 위험을 초래합니다.

작은 간섭 RNA(siRNA)가 항바이러스제로 효과적으로 사용된 여러 이전 연구의 성공을 뒷받침하여18,19,20,21 비강 내(in) 투여되는 siRNA가 다음과 같은 감염에 대한 백신 증강 조치로 특히 적합할 것이라고 생각했습니다. 전파를 완화하는 데 사용될 수 있는 상부 호흡기관.

이를 위해 우리는 초강력 후보를 식별하기 위해 SARS-CoV-2 게놈을 표적으로 하는 16,000개 이상의 RNA 간섭(RNAi) 트리거를 스크리닝했습니다. 이 스크린은 바이러스에 대한 각 siRNA 후보의 침묵 활성을 요약하기 위해 합성 생물학 시스템을 사용하는 대규모 병렬 분석인 Sens.AI에 의존했습니다. 이전 연구22,23에서는 이전 버전의 Sens.AI를 사용하여 HIV 및 HCV에 대한 강력한 siRNA를 식별했습니다. 그러나 이전 설계는 수행하는데 6개월 이상 소요될 정도로 비효율적이었습니다. 새로운 설계에서 우리는 힘든 실험 단계 대신 통계 학습을 사용하여 신호 대 잡음비를 향상시키는 더 빠른 방법을 발명했습니다. 광범위한 계산 분석과 시험관 내 실험을 통해 두 가지 초강력 siRNA 후보의 혼합체가 생성되었으며, 이는 테스트된 모든 바이러스 균주에 대해 효과적인 것으로 입증되었습니다. 마지막으로. 이 siRNA 칵테일의 비강 내 투여는 SARS-CoV-2의 시리아 햄스터 모델에서 효과적인 것으로 확인되었습니다.

1.4uM). Overall, these results show that our novel genome-wide screening method identifies hyper-potent siRNAs within a single cycle./p>95%. Interestingly, both S8 and S10 showed weak responses, at the level of ~10% SARS-CoV-2 inhibition compared to the control siRNA, despite very high potency in the reporter assay (IC50 < 20 pM). However, unlike the other siRNA candidates, these two target the virus's negative strand, which is an intermediary in the replication process. Therefore, we hypothesised that targeting this intermediary RNA molecule likely would not interfere with viral replication. To further confirm our top candidates, we assessed the effect on live virus infectivity in cells using TCID50 assay (Fig. 3b). Again, we found a strong inhibitory activity of the top three out of four siRNAs, with viral repression exhibiting approximately two orders of magnitude compared to the GFP siRNA control. We next used the same settings to test five of the most potent siRNAs from the open-source discovery method (Supplementary Table 3). Only one candidate, Hel14, displayed repression levels of the viral load by >95%, on par with the levels exhibited by the top siRNAs from our Sens.AI screen (~90% inhibition) (Fig. 3c)./p>95% repression) (Fig. 3f). Interestingly, S5 was tolerant and showed efficacy against the Delta strain despite the fact that it possesses a mutation in position 14 of its target site. Second, we tested the S5/Hel14 cocktail against Omicron BA.1 using a similar setting. Similar to other reports33, the Omicron variant did not replicate as fast as other VoCs in vitro. Since these lower replication rates reduced the dynamic range of our assays, we added two positive controls, chloroquine and molnupiravir, both of which demonstrated as potent inhibitors of Omicron BA.1. The activity of the S5/Hel14 cocktail was indeed diminished in the Omicron variant. Nevertheless, it inhibited viral replication to a similar level as was induced by the positive control treatments (Fig. 3g). This finding suggested that the more modest inhibition was likely the result of a lower dynamic range due to slow viral replication, rather than due to reduced potency of the RNAi cocktail itself. Finally, we tested the activity of the cocktails against our novel replicon system, which recapitulated the function, but not infectivity of the Beta SARS-CoV-2 strain34. Consistently, the cocktails repressed the replicon by 10-15 fold, indicating that they confer a robust inhibition profile across diverse VoCs34. Importantly, analysis of high throughput sequencing data showed that cells that were treated with the S3/S5 cocktail exhibited a specific profile of depletion of reads at the siRNA cleavage sites (Fig. 3h). These data provide mechanistic support to confirm that the observed reduction in viral load was directly related to siRNA silencing./p>51% reduction in this score. Based on previous studies, the former mutation type is seven times more common than the latter36, suggesting that S5 could tolerate to some extent the more prevalent type of double mutations in the target site./p>7% weight loss at Day 5 postinfection, consistent with previous studies38,39,40. The siRNA-treated group benefited from significant protection against weight loss compared to this negative control group (p < 0.05; bootstrap hypothesis testing and Bonferroni adjusted) (Fig. 5b). This weight loss was statistically indistinguishable from the positive control group that was treated with bamlanivimab. In addition, we observed an order of magnitude suppression of viral load in the lungs of the active treatment group (Day 5) compared to the negative control, as measured by qPCR measurement of the RdRP gene (ΔVLlung = 10.3x, plung < 0.001; bootstrap hypothesis testing and Bonferroni adjusted) (Fig. 5c). Similarly, we also observed a significant suppression, albeit to a lesser extent, of viral load in the nares (ΔVLlung = 2.5x, plung < 0.05; bootstrap hypothesis testing and Bonferroni adjusted) (Fig. 5d). In both cases, the antibody was more effective than the siRNA treatment, suggesting that additional dose optimization studies are required in order to fully develop the siRNA cocktail into a viable prophylactic./p>